Лечение ревматоидного артрита: важные моменты
Автор: Иванова Мария / Учреждение / ivanova@mail.ru
После установления диагноза РА, основными целями лечения является контроль активности болезни и замедление скорости разрушения суставов, а также минимизация боли, скованности, воспаления и осложнений. Фармакологические препараты, используемые включают не биологические и биологические ПрМФП и вспомогательные агенты, такие как кортикостероиды, НПВП и обезболивающие.
Раннее лечение ПрМФП
ПрМФП представляют собой наиболее важное мероприятие в успешном лечении РА. Эти препараты могут замедлить или предотвратить прогрессирование болезни и, таким образом, разрушение суставов и последующую потерю функции. Успешная терапия ПрМФП может устранить необходимость в других противовоспалительных или обезболивающих препаратах; однако, до полного начала действия ПрМФП, противовоспалительные или обезболивающие препараты могут быть использованы в качестве переходной терапии для снижения боли и опухолей.
Небиологические ПрМФП
Миноцклин может действовать как ПрМФП благодаря своему действию в качестве ингибитора металлопротеиназы (ММП). Инъекционные золотые соли и пеницилламин редко вызывают устойчивую ремиссию и, таким образом, в основном были заменены более эффективными препаратами.
Принятые меры и побочные эффекты
Острые и хронические инфекции, демиелинизирующие нарушения, декомпенсированная сердечная недостаточность класса III или IV и недавние опухоли являются противопоказаниями для использования ингибиторов TNF. Рекомендуется тщательное поиск латентной туберкулеза с использованием тестирования на протеинобразующий препарат (ППД) или анализа на выявление гамма-интерферона (ИФН) с возможностью рентгенографии грудной клетки до начала применения этих средств.
Пациентам, получающим анти-TNF препараты, следует избегать вакцинации живыми вирусами. Проведение живых вакцин пациентам, получающим иммуносупрессивные препараты, повышает риск серьезных инфекций.
Ингибиторы TNF против MTX
Янускиназы (JAK) представляют собой группу внутриклеточных тирозинкиназ, которые передают сигналы от взаимодействий цитокинов или факторов роста с рецепторами на клеточной мембране для влияния на клеточные процессы гемопоэза и функции иммунных клеток. В рамках сигнального пути JAK фосфорилируют и активируют статистические трансдукторы и активаторы (STAT), которые регулируют внутриклеточную активность, включая экспрессию генов.
Ингибиторы JAK модулируют сигнальный путь в точке JAK, предотвращая фосфорилирование и активацию STAT. Эти сигналы поддерживают воспалительное состояние при РА. Ингибирование JAK снижает производство и модулирует противовоспалительные цитокины, центральные для РА.
В 2016 году FDA одобрило разовую дозу продленного действия 11 мг в качестве альтернативы схеме 5 мг два раза в день.
Новые лекарства для лечения ревматоидного артрита
FDA одобрило второй ингибитор JAK, барицитиниб (Olumiant), в 2018 году в качестве лечения второй линии умеренно или сильно активного РА у взрослых, у которых неадекватно реагировали на одного или более антагонистов ТНФ. Барицитиниб может использоваться как монотерапия или в комбинации с метотрексатом или другими не биологическими ДМПЖ. Он не должен использоваться в сочетании с биологическими ДМПЖ или мощными иммунодепрессантами (например, азатиоприном или циклоспорином).
Другой ингибитор JAK, упадацитиниб, был одобрен в 2019 году для умеренно или сильно активного РА у взрослых, у которых неадекватно реагировали или к которым была непереносимость метотрексата. Он может использоваться как монотерапия или в комбинации с метотрексатом или другими не биологическими ДМПЖ.
Сочетание терапии с ДМПЖ
В клинических исследованиях 30-70% пациентов, использующих ДМПЖ как монотерапию или в комбинационной терапии, достигают частичных ответов, определяемых по ACR оценке активности заболевания. В настоящее время невозможно предсказывать, у каких пациентов не будет ответа на лечение.
В клинической практике используются три стратегии для снижения активности заболевания как можно сильнее у пациентов, у которых заболевание не реагирует или у тех, у кого имеются недостаточные клинические ответы:
- Изменение дозы ДМПЖ или закаливание одного из них;
- Добавление другого ДМПЖ к используемой схеме;
- Переход полностью к новой группе ДМПЖ.
Поскольку пациентам может потребоваться 2-3 месяца для достижения полного ответа на ДМПЖ, решения о изменении лекарства часто задерживаются до этого времени.
Токсичность комбинаций этих лекарств редко бывает более значительной, чем токсичность, проявляющаяся при использовании любого из индивидуальных агентов по отдельности, хотя печеночная и костномозговая токсичность может увеличиться при комбинировании МТК и лефлуномида.
При использовании с подходящим контролем клинического и лабораторного мониторинга комбинированная терапия вышеперечисленными агентами обычно хорошо переносится. Нежелательные явления обычно становятся более редкими после первых 2-3 месяцев терапии. Большинство нежелательных явлений обратимы при прекращении приема лекарств или снижении их доз.
Осложнения лечения агентами ДМПЖ
Осторожность с TNF и смертность
Глюкокортикоиды
НПВП взаимодействуют с синтезом простагландинов через ингибирование фермента циклооксигеназа (COX), тем самым уменьшая отек и боль. Однако они не замедляют разрушение суставов и, следовательно, недостаточны для лечения РА при использовании в одиночку. Как и глюкокортикоиды, НПВП могут быть снижены по дозе или прекращены с успешной терапией ДМПЖ.
Несколько десятков НПВП, доступных на рынке, могут быть классифицированы на несколько различных групп соединений. К наиболее часто используемым НПВП относятся ибупрофен, напроксен, кетопрофен, пироксикам и диклофенак.
Новые терапии и методы лечения ревматоидного артрита
В начале 1990-х годов был обнаружен второй изоформ COX (COX-2). COX-1 имеет защитную функцию, особенно в желудке, в то время как COX-2 сильно усиливается во время воспаления. Традиционные нестероидные противовоспалительные препараты являются неселективными ингибиторами COX, подавляющими как COX-1, так и COX-2. Было создано несколько селективных ингибиторов COX-2 (coxibs), которые имеют значительное предпочтение к COX-2 перед COX-1. Однако на данный момент только один ингибитор COX-2 остается на рынке США — именно целекоксиб.
Ксибы, благодаря своей селективности к COX-2, показали клиническую эффективность и вызывают меньшую токсичность для ЖКТ, которая является основным нежелательным событием, связанным с использованием неселективных ингибиторов COX (т.е. НПВП). Другие побочные эффекты, такие как задержка воды, гипертония и аномальные уровни трансаминаз, наблюдаются как с неселективными ингибиторами COX, так и с селективными ингибиторами COX-2.
Обезболивающие
Ацетаминофен, трамадол, кодеин, опиаты и различные другие анальгетики также могут быть использованы для снижения боли. Эти средства не влияют на отек или разрушение суставов.
Экспериментальные терапии
Несмотря на значительные достижения за последние десятилетия, РА по-прежнему остается хроническим заболеванием. Оно остается активным у многих пациентов, у которых состояние частично или полностью не отвечает на МФПД. Поэтому продолжается настойчивый поиск новых терапевтических средств.
В настоящее время идет изучение нескольких новых биологических агентов, направленных на CD20 B-клетки, включая атацицепт, AMG 623, B3-FCc, Br3-Fc, белимумаб, эпратузумаб, офатумумаб, окрелизумаб и TRU-015. Малые молекулы, направленные на ферменты, участвующие в сигнальной трансдукции ТНФ и других провоспалительных цитокинах, эффективны при лечении РА.
Ингибирование металло-протеиназ (ММП), хоть в начале было безуспешным, может оказаться эффективным, также как и ингибирование активации остеокластов. Исследуются аферезные процедуры. Высокодозные иммуносупрессивные методы, совмещенные с трансплантацией аутологичных стволовых клеток, применяются в протоколах исследований для пациентов, которые не отвечают на другие терапии.
Аномальное выражение транспортеров, связанных с глутаминолизом, является общей чертой KRAS-мутантного ОКР
Хотя известно, что глутаминолиз, последовательность ферментативных реакций, эффективен для производства энергии и биосинтеза, функции транспортеров метаболитов глутаминолиза в значительной степени неизвестны. Поэтому мы первым делом проанализировали транскрипционные уровни 29 SLC транспортеров метаболитов, связанных с глутаминолизом, в образцах человеческого KRAS-мутантного ОКР и смежных нормальных образцов из TCGA и обнаружили 21 транспортеров с значительно дифференциальным выражением, включая 8 повышенных и 13 пониженных в KRAS-мутантном ОКР (P < 0,05, Дополнительная фигура 1; дополнительный материал доступен онлайн к этой статье; https://doi.org/10.1172/jci.insight.167874DS1).
Поскольку митохондриальный метаболизм необходим для туморогенеза, вызванного KRAS, мы обратили особое внимание на митохондриальные SLC. SLC25A22 был единственным повышенным геном в образцах KRAS-мутантного ОКР и продемонстрировал свою способность способствовать выживанию клеток KRAS-мутантного ОКР путем увеличения потока глутамата из цитозола в митохондрии (). Среди пониженных SLC SLC25A21 был транспортером с самым дифференциальным выражением. Транспортеры SLC25A21 катализируют транспорт 2-OA и α-КГ по контробменному механизму (). Учитывая, что α-КГ является необходимым метаболитом в глутаминолизе (), мы сосредоточились на SLC25A21 и исследовали его воздействие на механизмы, с которыми он перепрограммирует метаболизм глутамина в KRAS-мутантном ОКР.
SLC25A21 expression is downregulated in CRC and is positively correlated with prognosis in KRAS-mutant CRC. We next assessed the endogenous expression levels of SLC25A21 in a panel of cell lines and in paired CRC and adjacent noncancerous mucosa tissue samples. Compared with that in FHC cells, SLC25A21 was significantly downregulated in KRAS-mutant CRC cell lines (P < 0.0001, Figure 1A). A similar trend was observed in CRC cells with wild-type (WT) KRAS, but no significant differences were found between the 2 groups of CRC cell lines (P = 0.5774, Figure 1A). These findings were also reflected at the protein level (Figure 1B). Consistent with the cell line data, the SLC25A21 mRNA (P = 0.0002, Figure 1C) and protein (P = 0.0103, Figure 1D) were lower in KRAS-mutant CRC tissues than in paired noncancerous tissues. Correspondingly, downregulated expression was also observed in CRC tissues with WT KRAS (P < 0.05), but we did not find significant differences between the 2 groups of CRC tissues with KRAS mutation and WT KRAS (Figure 1, C and D). Moreover, the SLC25A21 downregulation was found in KRAS-mutant CRC tissues compared with paired normal samples from TCGA cohort (P = 0.0017, Figure 1E). Furthermore, IHC assays revealed that SLC25A21 protein expression was heterogeneous and confirmed a significant decrease in the SLC25A21 protein level in both KRAS-mutant and KRAS-WT CRC tissues (P < 0.01, Figure 1F), but no significant differences were found between the 2 groups of CRC tissues (P = 0.1641).
SLC25A21 expression is downregulated in CRC and positively correlated with prognosis in patients with KRAS-mutant CRC. (A) The SLC25A21 transcript levels in an immortalized colon mucosa epithelial cell line (FHC) and CRC cell lines were quantified by real-time RT-PCR (n = 3 biologically independent experiments). (B) Immunoblot analysis of SLC25A21 protein in FHC and CRC cells from A. An anti-tubulin antibody was used for normalization. (C and D) SLC25A21 mRNA (C, n = 20 per group) and protein levels (D, KRAS mutation, n = 12; WT KRAS, n = 10) in paired CRC and adjacent noncancerous tissues. (E) Transcript abundance of SLC25A21 in paired KRAS-mutant CRC and noncancerous tissue samples from TCGA (n = 17). (F) Representative micrographs of SLC25A21 expression patterns in normal colorectal mucosa and CRC tissues by IHC (left). Scale bars: 100 μm (top) or 50 μm (bottom). Quantification of SLC25A21 IHC staining in normal colorectal mucosa and CRC tissues (right upper, KRAS mutation, normal, n = 31; tumor, n = 73. right bottom, WT KRAS, normal, n = 35; tumor, n = 68). (G) Kaplan-Meier survival curves for CRC patients with KRAS mutation (upper, high expression, n = 117; low expression, n = 114) and WT KRAS (bottom, high expression, n = 12; low expression, n = 13) stratified by the median level of SLC25A21 expression from TCGA. The immunoblots in B are representative of 2 independent experiments. Data are represented as mean ± SD. Statistical significance was calculated by unpaired, 2-sided t test (A, C, D, and F), paired, 2-sided t test (C–E), 1-way ANOVA with Dunnett’s post hoc test (A, comparison between FHC cells and CRC cell lines), and log-rank test (G); the P values are shown.
We then validated the prognostic significance of SLC25A21 levels in CRC patients using TCGA data. Interestingly, SLC25A21 downregulation was correlated with poor survival in KRAS-mutant CRC (log-rank test P = 0.0336), but not in CRC with WT KRAS (log-rank test P = 0.9206, Figure 1G).
SLC25A21 inhibits cell growth and invasion in KRAS-mutant CRC in a KRAS-mutation-dependent manner in vitro. (A) Immunoblot analysis of SLC25A21 protein levels in CRC cells with or without SLC25A21 overexpression or knockdown. (B) Proliferation of KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells with SLC25A21 overexpression (upper, n = 3 biologically independent experiments) or knockdown (bottom, n = 3–5 biologically independent experiments). (C and D) Representative images (left) and quantification (right) showing the colony-forming capacity of KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells with SLC25A21 overexpression (C, n = 3 biologically independent experiments) or silencing (D, n = 3 biologically independent experiments). (E) Representative images (left) and quantification (right) showing the growth of primary human CRC organoids with KRAS mutation or WT KRAS. (F and G) Proliferation (F, n = 3 biologically independent experiments) and colony-forming capacities (G, n = 3 biologically independent experiments) of HT29 cells with or without expression of mutated KRASG12D or SLC25A21 knockdown. (H and I) Invasiveness of KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells with SLC25A21 overexpression (H) or knockdown (I, n = 5 biologically independent experiments). (J) Invasiveness of HT29 cells from G, treated as shown (n = 3 biologically independent experiments). Scale bars: 50 μm. SLC25A21-OE, SLC25A21 overexpression; SLC25A21-KD, SLC25A21 knockdown; NS, nonsignificant. The immunoblots in A are representative of 2 independent experiments. Data are presented as the mean ± SD. Statistical significance was calculated by 2-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc test (B and F), unpaired, 2-sided t test (C–E, H, and I), and 1-way ANOVA with Dunnett’s post hoc test (G and J). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
To determine whether a direct causal link exists between the acquisition of KRAS mutation and the dysregulation of SLC25A21 expression, we introduced KRASG12D into HT29 cells. The introduction of KRASG12D into HT29 cells did not alter SLC25A21 expression (Supplemental Figure 2C). Interestingly, SLC25A21 depletion increased the proliferation rate and colony formation capacity of HT29 cells in a KRAS-mutation-dependent manner (Figure 2, F and G). In addition, we determined the effects of SLC25A21 on pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells with KRAS mutation (AsPC-1 and MIA PaCa-2) or WT KRAS (BxPC-3) and found that SLC25A21 upregulation inhibited the proliferation and colony formation of the 2 KRAS-mutant PDAC cell lines, but not of BxPC-3 cells (Supplemental Figure 3). Together, these data indicate that SLC25A21 selectively affects KRAS-mutant cancer cells.
SLC25A21 selectively suppresses cell invasion and migration in KRAS-mutant CRC cells in vitro. We conducted Matrigel invasion and wound-healing assays to assess the effects of SLC25A21 on cell invasion and migration. The invasion assays illustrated that ectopic overexpression of SLC25A21 markedly suppressed cell invasion in KRAS-mutant CRC cells (M5 cells, P = 0.0012; SW620 cells, P < 0.0001) but not in Caco-2 cells (P = 0.9546, Figure 2H). Moreover, wound-healing assays revealed that SLC25A21 overexpression significantly reduced the migration potential of both M5 and SW620 cells (P < 0.01), but not of Caco-2 cells (P = 0.6360, Supplemental Figure 4A). In contrast, SLC25A21 downregulation selectively promoted cell invasion (P < 0.0001) and migration (P < 0.05) in KRAS-mutant cells (Figure 2I and Supplemental Figure 4B). Similarly, SLC25A21 depletion also increased the migration and invasion abilities of HT29 cells expressing KRASG12D (Figure 2J and Supplemental Figure 4C). Hence, SLC25A21 plays important suppressor roles in the cell migration and invasion of KRAS-mutant CRC cells.
SLC25A21 inhibits the tumorigenicity and metastasis of KRAS-mutant CRC cells in vivo. (A) Bright-field images of tumors (left) and growth curves of tumor volume (right) from nude mice ectopically transplanted with CRC cells with or without SLC25A21 overexpression (n = 6 per group). The graphs show data from the tumor xenografts at 15 or 24 days after cells were ectopically and subcutaneously implanted. (B) Representative IHC staining (left) and quantification (right) showing the Ki-67 index of tumor xenografts from CRC cells (n = 5). Scale bars: 50 μm. (C) Representative H&E staining images showing lung metastases from nude mice 4 weeks after tail vein injection of CRC cells with or without SLC25A21 overexpression (n = 9 per group). Scale bars: 100 μm (top) or 50 μm (bottom). (D) Quantification of pulmonary tumor colonies after tail vein injection of CRC cells with SLC25A21 overexpression or control cells. (E) Statistical comparisons of lung metastases after tail vein injection of SLC25A21-overexpressing and control cells (n = 9 per group). Data are presented as the mean ± SD. Statistical significance was calculated by 2-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc test (A), unpaired 2-sided t test (B and D), and Fisher’s exact test (E). *P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001.
We further explored the role of SLC25A21 in lung metastasis by establishing a tail vein injection model in nude mice. The results showed that SLC25A21 upregulation markedly decreased the in vivo metastasis of CRC cells. M5 cells overexpressing SLC25A21 formed lung metastases in only 1 out of 9 mice, whereas lung metastasis was identified in 6 out of 9 control mice. However, in KRAS-WT CRC cells, neither SLC25A21-overexpressing Caco-2 nor control cells showed lung metastasis (Figure 3, C–E). In addition, SLC25A21 silencing increased the lung metastasis of HCT116 cells with KRAS mutation (Supplemental Figure 5, C–E). Collectively, the in vivo data indicate that SLC25A21 plays an important inhibitory role in tumor growth and metastasis, consistent with the results from in vitro assays.
Moreover, a marked increase in ATP production was observed as a result of SLC25A21 downregulation in KRAS-mutant cells. In KRAS-WT cells, SLC25A21 downregulation increased ATP production, but this effect was less substantial than that observed in KRAS-mutant cells. In addition, SLC25A21 depletion decreased the NADP+/NADPH ratio and reactive oxygen species (ROS) production in KRAS-mutant CRC cells (Figure 4F), indicating enhanced redox homeostasis. Furthermore, we suppressed the level of oxidative phosphorylation (OxPHOS) in CRC cells with IACS-010759 (100 nM), an inhibitor of OxPHOS, to test the contribution of OxPHOS to the important role of SLC25A21 depletion. In KRAS-mutant CRC cells, IACS-010759 treatment could restore the promoting effect mediated by SLC25A21 depletion on colony formation to a level similar to that found with the control cells. However, neither SLC25A21 depletion nor IACS-010759 treatment had a significant effect on the growth of KRAS-WT cells (Supplemental Figure 6B). These data indicate that SLC25A21-depleted KRAS-mutant CRC cells are more sensitive to OxPHOS inhibitors.
SLC25A21 downregulation promotes KRAS activity and activates the downstream PI3K/AKT and RAF/ERK signaling pathways. KRAS is a small GTPase that normally cycles between a GTP-bound active and a GDP-bound inactive form. KRAS mutation favors the formation of persistently GTP-bound KRAS, the active state. In the TCA cycle, α-KG undergoes oxidative decarboxylation to succinyl-CoA, and CoA from succinyl-CoA is then removed to generate free succinate via a process coupled to the substrate-level phosphorylation of GDP to GTP, the only way to directly generate a high-energy phosphate bond reaction in the TCA cycle (Figure 5A). We hypothesized that SLC25A21-depletion-mediated α-KG arrest increases GTP production and thereby promotes persistent KRAS activation in KRAS-mutant CRC. LC–tandem MS (LC-MS/MS) analysis showed a significantly elevated GTP abundance in SLC25A21-depleted HCT116 cells (P < 0.0001, Figure 5B). Accordingly, in all KRAS-mutant cell lines, SLC25A21 depletion increased KRAS activity, whereas SLC25A21 overexpression inhibited KRAS activity. However, SLC25A21 depletion had little effect on KRAS-WT CRC cells (Figure 5C and Supplemental Figure 7A).
The ability of SLC25A21 downregulation to promote KRAS activity and cell proliferation requires SUCLG2 in KRAS-mutant CRC cells. (A) Schematic diagram of the effect of glutaminolysis on KRAS-mediated downstream signaling pathways. (B) Quantitative analyses of the intracellular GTP levels by LC-MS/MS (n = 5 biologically independent samples). (C) Immunoblot analysis of KRAS activity in KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells with or without SLC25A21 or SUCLG2 depletion. (D) Immunoblot analysis of the activity of the PI3K/AKT and RAF/ERK pathways in KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells with or without SLC25A21 knockdown. (E and F) Representative images (left) and quantification (right) of the colony-forming capacity (E) and invasiveness (F) of CRC cells from C, treated as shown (n = 3 biologically independent experiments). Scale bars: 50 μm. (G) Representative images (left) and quantification (right) of the colony-forming capacity of CRC cells with or without SLC25A21 overexpression or SUCLG2 knockdown in the absence or presence of α-KG or Gln addition, treated as shown (n = 3 biologically independent experiments). Cells were cultured in normal medium (Gln-containing, 2 mM) or conditioned medium with α-KG addition (2 mM) or Gln addition (total of 4 mM Gln). The immunoblots in C and D are representative of 2 independent experiments. Data are represented as mean ± SD. Statistical significance was calculated by unpaired, 2-sided t test (B) and 1-way ANOVA with Tukey‘s post hoc test (E–G). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
KRAS mediates the downstream PI3K/AKT and RAF/ERK signaling pathways to promote cancer cell proliferation and metastasis (). Hence, we sought to examine the effect of SLC25A21 on these pathways. The levels of p-AKT/p-ERK were increased and decreased in SLC25A21-depleted and SLC25A21-overexpressing CRC cells with KRAS mutation (Figure 5D and Supplemental Figure 7B), respectively, whereas no significant differences were found in KRAS-WT HT29 cells (Figure 5D). Collectively, these data indicate that SLC25A21 inhibits cancer cell growth and metastasis by repressing the KRAS/AKT/ERK pathway in KRAS-mutant CRC.
The effects of SLC25A21 downregulation on KRAS-mutant CRC depend on Gln-derived α-KG–mediated replenishment of the TCA cycle. α-KG undergoes oxidative decarboxylation to generate succinyl-CoA and subsequently succinate. Succinate-CoA ligase GDP-forming subunit-β (SUCLG2), a subunit of succinyl-CoA synthetase (SCS), is critical for the conversion of succinyl-CoA into succinate. To further ascertain the contribution of Gln-derived α-KG–mediated replenishment of the TCA cycle to the effects of SLC25A21, we inhibited the conversion of α-KG into succinate via an siRNA targeting SUCLG2 in SLC25A21-depleted CRC cells. Remarkably, SUCLG2 downregulation completely abolished the increases in KRAS activity, colony formation, and migration mediated by SLC25A21 downregulation in KRAS-mutant CRC cells (Figure 5, C, E, and F, and Supplemental Figure 8A). However, SUCLG2 downregulation had little effect on KRAS-WT cells (Figure 5, E and F, and Supplemental Figure 8A). Moreover, in KRAS-mutant CRC cells, supplementation with α-KG or additional Gln in Gln-containing full medium rescued the decrease in proliferation and migration mediated by SLC25A21 overexpression, whereas SUCLG2 downregulation abolished the rescue effect of Gln or α-KG supplementation in culture medium on the proliferation and migration of SLC25A21-overexpressing cells, but not KRAS-WT CRC cells (Figure 5G and Supplemental Figure 8B). Thus, the rescue effects of SUCLG2 knockdown or α-KG/Gln supplementation confirmed the crucial role of SLC25A21 in repressing KRAS-mutant CRC progression by arresting α-KG efflux from mitochondria and thus promoting anaplerotic Gln flux into the TCA cycle.
Restoration of SLC25A21 expression abrogates KRAS-mutation-mediated resistance to cetuximab in CRC. KRAS mutation, which results in hyperactive PI3K/AKT and RAF/ERK signaling (), is responsible for resistance to anti-EGFR antibody therapy (). After establishing the potent inhibitory effect of SLC25A21 on PI3K/AKT and RAF/ERK activity in KRAS-mutant CRC, we hypothesized that SLC25A21 affects the sensitivity of KRAS-mutant cells to anti-EGFR antibody therapy in CRC. As expected, SLC25A21 overexpression restored CTX sensitivity in 5 KRAS-mutant cell lines (Figure 6A). However, the manipulation of SLC25A21 levels did not affect the CTX sensitivity of KRAS-WT CRC cells compared to their parental cells (Figure 6B). Furthermore, we transfected plasmids harboring KRASG12D into Caco-2 and HT29 cells to create KRAS-mutant cells. Interestingly, SLC25A21 increased the CTX sensitivity of KRASG12D-expressing Caco-2 and HT29 cells (Figure 6C), indicating that the CTX sensitivity mediated by SLC25A21 requires KRAS mutation. To determine whether SLC25A21 has an antiproliferative effect in combination with CTX, a colony formation assay was performed. Consistently, SLC25A21 overexpression in combination with CTX inhibited the colony formation of KRAS-mutant CRC cells (Figure 6, D and E).
Subsequently, we knocked down SUCLG2 expression with siRNA in CRC cells with SLC25A21 depletion to repress GTP production. The CCK8 and colony formation assay results showed that SUCLG2 knockdown completely overcame the CTX resistance of KRAS-mutant CRC cells with SLC25A21 depletion but not KRAS-WT HT29 cells (Figure 6, F and G). In summary, these data suggest that decreasing GTP production by overexpressing SLC25A21 to reduce the available raw material for the conversion of α-KG to succinate and/or inhibiting SCS activity inhibits KRAS activity, which may be a potential treatment strategy for CRC patients with KRAS mutations.
SLC25A21 downregulation results from the inhibition of α-KG–dependent DNA demethylases induced by arrest of α-KG efflux. To explore the underlying mechanisms that contribute to SLC25A21 downregulation in CRC, we performed a computational screen. Analysis of ENCODE data identified a 647-bp CpG island and higher methylation within the SLC25A21 promoter region. Methylation-specific PCR was conducted to assay CpG methylation in the SLC25A21 promoter. As shown in Figure 7A, an unmethylated band was found in FHC cells, whereas a methylated band was observed in both KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells. We next expanded the methylation analysis to CRC tissue samples and found that the methylation levels of SLC25A21 were significantly elevated in KRAS-mutant CRC tissues compared with normal tissues. A similar result was observed in KRAS-WT CRC tissues (Figure 7A). In addition, treatment with 5-aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC), a DNA demethylation agent, or the methyl group donor S-adenosylmethionine (SAM) led to an increase and decrease in SLC25A21 mRNA in CRC cells, respectively (Supplemental Figure 9). These data indicate that DNA hypermethylation of the SLC25A21 promoter is critical for the observed SLC25A21 downregulation in CRC.
SLC25A21 downregulation results from the inhibition of α-KG–dependent DNA demethylases induced by arrest of α-KG efflux. (A) Analyses of the methylation status of the SLC25A21 gene in FHC and CRC cell lines, and CRC and paired normal tissue samples ascertained by methylation-specific PCR. Top: FHC cells and KRAS-mutant and KRAS-WT CRC cells (n = 13). Bottom: CRC with KRAS mutations or WT KRAS and paired normal tissues (n = 6). U, unmethylated; M, methylated; N, normal; T, tumor. (B) DNA dot blots assessing the 5-hmC levels of KRAS-mutant and KRAS-WT CRC with or without SLC25A21 overexpression or SLC25A21 knockdown in the absence or presence of α-KG (2 mM) or Bobcat339 (80 μM) for 48 hours. The blot images are representative of 2 independent experiments. (C) Relative expression of SLC25A21 in KRAS-mutant CRC cells with or without SLC25A21 overexpression or SLC25A21 knockdown in the absence or presence of α-KG (2 mM) or Bobcat339 (80 μM) for 48 hours (n = 3 biologically independent experiments). Data are represented as mean ± SD. Statistical significance was calculated by 1-way ANOVA with Tukey’s post hoc test. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. (D) Schematic illustration showing the mechanism of action of SLC25A21 in KRAS-mutant CRC. The illustration was created with BioRender.
α-KG is a pleiotropic compound that serves as a metabolite and as a cofactor for numerous enzymes. The ten-eleven translocation (TET) family is a group of DNA demethylases that are dioxygenases requiring α-KG as a cofactor (). We hypothesized that SLC25A21 downregulation inhibits TET demethylase activity by repressing α-KG efflux in CRC. Dot blot assays confirmed that SLC25A21 overexpression increased the abundance of 5-hmC marks to equal that observed with α-KG addition, and this effect was restored by treatment with Bobcat33, a TET1/2 inhibitor (), in KRAS-mutant CRC cells (Figure 7B). In contrast, SLC25A21-depletion-mediated TET inhibition decreased the abundance of 5-hmC marks compared with those in the control, and the effect was equal to that observed with Bobcat339 treatment. The inhibition of 5-hmC deposition by SLC25A21 depletion was reversed by α-KG addition (Figure 7B). In KRAS-WT CRC cells, both α-KG addition and Bobcat339 treatment changed the abundance of 5-hmC marks, whereas SLC25A21 knockdown only exerted a slight effect (Figure 7B), which was consistent with the extent through which SLC25A21 downregulation mediated mitochondrial α-KG efflux (Figure 4A). Moreover, we examined the changes in SLC25A21 expression. Similar to the effect of SLC25A21 overexpression, α-KG supplementation to the KRAS-mutant CRC cell culture medium induced the transcription of SLC25A21, and this effect was abrogated by Bobcat339 treatment (Figure 7C). In contrast, the SLC25A21 transcript levels were reduced by inhibition of TET activity, and the effect was similar to that observed with SLC25A21 knockdown that was reversed by α-KG supplementation (Figure 7C). Collectively, these results indicate a positive feedback mechanism involving SLC25A21 expression and α-KG–dependent TETs in CRC cells.